深度好文| 从新冠病毒机理上，探讨NK细胞治疗的可行性

2019年末，被国际病毒分类委员会命名为严重急性呼吸综合征冠状病毒2”(severe acute respiratory syndrome coronavirus 2,SARS-CoV-2)的冠状病毒开始流行，造成严重感染以及部分患者死亡，引起全世界的重视。2020年1月20日，国家卫健委高级别专家组成员高福院士表示SARS-CoV-2是目前已知的第7种冠状病毒，其余6种分别是人冠状病毒299E（human coronavirus 299E，HCoV-299E）、人冠状病毒OC43（human coronavirus OC43，HCoV-OC43）、人冠状病毒NL63 （human coronavirus NL63，HCoV-NL63）、人冠状病毒HKU1（human coronavirus HKU1，HCoV-HKU1）、严重急性呼吸综合征冠状病毒（severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-CoV）和中东呼吸综合征冠状病毒（Middle East respiratory syndrome coronavirus，MERS-CoV）[1]。

冠状病毒是具有外套膜的正链单股RNA病毒，1937年最先从鸡身上分离出来，平均直径100 nm，呈球形或椭圆形，病毒有包膜，包膜上存在棘突，整个病毒像日冕。其遗传物质是已知RNA病毒中最大的，多数感染野生动物，通过呼吸道分泌物排出体外，经口液、喷嚏、接触传染、也通过空气飞沫传播，感染高峰期在秋冬和早春。其中SARS冠状病毒的变种曾引起了2003的非典型性肺炎[2]。

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SARS-CoV-2病毒传染性强、危害大。目前，没有特效的治疗药物，研究一套有效的治疗方案仍非常必要。肺的上皮是人体内环境中与外界接触最大的表面，直接接触吸入空气中的病毒和细菌，从鼻咽到肺泡膜整个呼吸道的第一道防线是由先天免疫系统构成的[3]。因此，建议应用具有直接杀灭病毒感染细胞特性和免疫调节功能的围产组织来源NK细胞回输治疗SARS-CoV-2感染肺炎患者。

据现有资料，SARS-CoV-2病毒主要是通过表面S蛋白与宿主细胞上的受体血管紧张素转化酶2（angiotensin converting enzyme 2，ACE2）等结合进入宿主细胞[4]，在细胞内进行增殖并扩散。临床上病毒会引起患者全身性炎症、高铁血红蛋白血症、血流动力学不稳定以及多器官衰竭的细胞因子风暴综合征（cytokine storm syndrome，CSS）[5]，据报道，在重症监护病房（intensive care unit，ICU）的重症患者体内白细胞介素2（interleukin 2，IL-2）、IL-7、IL-10[6]、粒细胞集落刺激因子（granulocyte colony stimulating factor，G-CSF）、干扰素诱导蛋白10（interferon-inducible protein10，IP10）、单核细胞趋化蛋白1(monocyte chemoattractant protein-1，MCP-1)、巨噬细胞炎性蛋白1α（macrophage inflammatory protein 1α，MIP1α）和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α）的血浆浓度高[7]。目前有两大治疗难点：第一，病毒藏在细胞内，没有特效药；第二，严重病毒感染患者，免疫系统失调。

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自然杀伤（natural killer，NK）细胞由造血干细胞发育而来，是先天免疫系统的重要组成部分，是一类独特的淋巴细胞亚群，占外周血淋巴细胞总数的10%～15%[8]，总数以脾脏＞肺＞骨髓＞外周血＞淋巴结＞肝脏＞胸腺的顺序分布，表面标志物有CD3-、CD19-、CD16+、CD56+。成熟阶段的 NK 细胞根据表型分为CD56低表达CD16高表达（CD56dimCD16+）细胞[9]、CD56高表达CD16不表达（CD56brightCD16-）细胞、CD56不表达CD16高表达（CD56negCD16+）细胞3个亚群[10]，占比约90%的CD56dimCD16+ NK细胞，以杀伤功能为主；占比约10%的CD56brightCD16-细胞，以分泌细胞因子为主。

NK细胞参与对多种病毒的免疫应答反应，NK细胞不同于T细胞、B细胞，是一类无需预先致敏就能非特异性杀伤病毒感染细胞和肿瘤细胞的淋巴细胞[11]，NK细胞已被运用于治疗多类疾病，疫情期间，国家卫健委下发的《关于印发新型冠状病毒感染的肺炎诊疗方案（试行第二版）》提到可试用α干扰素（interferon α, IFN-α）雾化吸入，NK细胞可以大量产生干扰素[12]，其中的IFN-γ还被证明可以较为有效的预防或治疗埃博拉病毒[13]。

NK细胞的主要功能是免疫防御、免疫监视和自身稳定。具有独立的功能，发挥杀伤活性无需预先致敏[14]，不受主要组织相容性复合体（major histocompatibility complex，MHC）分子限制[15]，病毒感染的细胞由于MHCⅠ类分子表达下降，可逃避T细胞识别，但能激活NK细胞，从而与T细胞互补协同起免疫防御作用。NK细胞发挥作用时对正常细胞没有损伤，且对外界刺激应答迅速，识别度高，强度大，是抗病毒阶段的第一道免疫杀伤防线。具备强大的细胞因子和趋化因子分泌功能，有助于启动和活化包括T细胞、B细胞在内的其他免疫细胞，发挥机体整体免疫水平[16]。

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目前，NK细胞在抗病毒免疫中的作用已经得到了验证，包括丙型肝炎病毒[17]、EB病毒（Epstein-Barr virus，EBV）[18]、乙型肝炎病毒[19]、巨细胞病毒[20]、甲型流感病毒[21]、艾滋病毒[22]等，所以从已知的NK细胞作用机制和SARS-CoV-2的特点上看，理论上来说治疗应该有效。

当机体被病毒感染后，免疫系统会识别并产生相应的免疫反应，增加淋巴细胞数量抵抗病毒，杀伤病毒转染的靶细胞。但特殊的病毒（SARS病毒和SARS-CoV-2等）不但转染正常细胞，而且干扰免疫系统。所以可运用NK细胞的抗病毒机制，既有直接杀伤，又有免疫调节。

直接杀伤功能发挥作用无需预先致敏，单独识别和攻击异化的细胞。例如，经由受体Fcγ受体Ⅲ（Fc receptor Ⅲ，FcγRIII/CD16）结合被抗体包被的病毒感染细胞会激活NK细胞[23]，通过这种识别模式，NK细胞对几乎所有病毒感染细胞都具有特异性。

体内循环的NK细胞通常处于休眠状态，当识别到被病毒转染的靶细胞后就会被激活，通过释放穿孔素在靶细胞表面穿孔，产生裂解颗粒（颗粒酶、颗粒溶素），这些分子可诱导靶细胞死亡。与此同时，分泌的细胞因子γ干扰素（interferon γ，IFN-γ）、多种肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor, TNF)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）、IL-3等，通过与树突状细胞、巨噬细胞和T细胞相互作用来形成免疫应答。

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活化的NK细胞表面可表达凋亡相关因子Fas配体（Fas ligand，FasL）[24]和肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL），靶细胞进入程序性凋亡状态。

免疫调节功能，当人体免疫功能正常发挥作用时，可有效的抵御大部分疾病，如果免疫力过强或过弱，便导致不同程度的疾病。NK细胞则具有免疫调节功能[25]，通过细胞因子调节内环境，维持体内免疫平衡。临床研究发现，NK细胞与机体的其他免疫细胞通过相互作用平衡免疫状态和免疫功能。

正常的机体组织细胞MHC I类分子与NK细胞表面的杀伤细胞免疫球蛋白样受体（killer cell immnoglobulin-like receptor，KIR）结合产生抑制信号，避免了NK对自身健康细胞的误伤，根据以往的临床研究结果，回输应用NK细胞没有发现不良副作用[26]，已具备了作为临床应用的安全性和有效性。

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据报道，已有多项NK细胞治疗临床试验项目同时开展，例如：

①课题: “脐血NK细胞联合脐血间充质干细胞用于治疗新型冠状病毒肺炎(COVID-19)的临床研究 (ChiCTR2000029817) ”；评估联合脐血分离出的NK细胞与间充质干细胞治疗新冠肺炎的安全性与有效性。

②2020年4月2日，美国FDA批准允许在人体中测试：“一种来源于胎盘干细胞的同种异体现货型NK细胞疗法CYNK-001治疗COVID-19的疗效”；将开展的I/II期临床试验预计招募86例COVID-19成人患者，研究人员认为NK细胞进入患者体内后可杀死被新型冠状病毒（SARS-CoV-2）感染的人体细胞，并解决免疫系统导致的炎症问题。

③河南省新乡医学院朱武凌教授: “脐带血NK细胞治疗冠状病毒感染重症患者的临床研究（201100311100）”；针对应急救治新型冠状病毒感染发病的患者和高危人群感染开展临床研究。

综上所述，COVID-19可以说是人类近代史上最严重的流行病，但SARS-CoV-2的感染机制尚不完全清楚，临床治疗主要以对症治疗为主[27]，鉴于传播还在继续，疫苗开发耗时又长。因此可使用安全、有效、便利的围产组织来源的NK细胞，其长期冷冻保存也不会影响分离出的NK细胞扩增能力与免疫调节功能，围产组织来源的NK细胞更加年轻，增殖能力更强，靶细胞杀伤效率也更高，将其应用于SARS-CoV-2感染肺炎的预防和治疗，前景可期。

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